海贼王中路飞与草帽一伙的“分开”有几次重要节点，取决于你指的是哪一次：

1. 香波地群岛第一次分散：动画第405集（漫画第513话）左右，路飞一行在香波地群岛被巴索罗米·熊逐个拍飞，这是草帽一伙第一次被迫分开，405集是开始分散的一集，406集基本完成分散。

   

2. 顶上战争后约定两年后重聚：动画第516集左右，路飞在女儿岛得知伙伴们的消息，决定传达“两年后见”的讯息。

3. 和之国后再次分头行动：动画第1086集左右（和之国篇结束后），路飞、索隆、娜美、乌索普、山治、乔巴等与罗、基德分道扬镳，草帽一伙也短暂分成几路行动。

如果你问的是“草帽一伙第一次被迫分开”，最准确的答案是动画第405集开始。